Культивирование вирусов в культурах тканей
- Характеристики тканевых культур
- Цитопатическое действие вирусов
1. Для культивирования вирусов используют ряд методов. Это культивирование в организме экспериментальных животных, развивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще — эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращивания клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения рН среды и антибиотики для подавления возможного бактериального загрязнения.
Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жизнеспособность клеток удается сохранить лишь временно, и растущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедеятельность, но и активно делятся.
В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) — чаще в один слой (однослойные), а всуспензированных —взвешены в жидкой среде. По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают:
- первичные(первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5—10 пассажей;
- полуперевиваемыекультуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях;
- перевиваемыекультуры тканей, которые поддерживаются в течение неопределенно длительного срока в многочисленных генерациях.
Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемыеи перевиваемые тканевые культуры.
2.О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по ци-топатическому действию (ЦПД):
- деструкции клеток;
- изменению их морфологии;
- формированию многоядерных симпластов или синтиция в результате слияния клеток.
- в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут образовываться включения — структуры, не свойственные нормальным клеткам.
Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимземазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.
По локализации в клетке различают:
- цитоплазматические;
- ядерные;
- смешанные включения.
Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства(тельца Бабеша-Негри) и др.
О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу "бляшек" (негативных колоний). При культивировании вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте пораженных клеток образуютсязоны деструкции моно-сом — так называемые стерильные пятна, или бляшки.Это дает возможность не только определить число вирионов в 1 мл среды (считается, что одна бляшка является потомством одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по феномену бляшкообразования.
Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, можно считать реакцию гемадсорбции.При культивировании вирусов, обладающих гемагглютжирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти молекулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбировать на себе эритроциты — феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретет способность вызывать гемагглютинацию.
Наиболее распространенным методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод "цветной пробы". При размножении в питательной среде с индикатором незараженных
клеток культуры ткани вследствие образования кислых продуктов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.